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    軍團菌的濾膜法檢測方法

       軍團菌是一種環境感染性致病菌,可引起急性呼吸道傳染病,即軍團菌病。軍團菌分布極其廣泛,醫院、酒店等的供水系統、空調的冷卻系統等各種水源均易于滋生、污染軍團菌,并造成軍團菌病傳染的風險。即與水有關的地方均可能存在軍團菌。
      軍團菌傳播、感染有以下特點:
    1、透過空氣、水份感染,傳播帶季節性,超過50%病例在夏季發生。
    2、滋生在醫院、酒店的供水系統,通過過水龍頭、浴室傳播。
    3、可通過空調的冷卻系統,由通風口傳播并感染對象。
      軍團菌屬革蘭氏陰性桿菌,專性需氧,無芽孢,無莢膜,軍團菌需要半胱氨酸和鐵,無半胱氨酸時,軍團菌無法生長。生化特征還有不發酵也不氧化糖類,不還原硝酸鹽,氧化酶實驗陰性或弱陽性,尿素酶陰性,軍團菌生長的最適pH為6.9-7.0,2%-5%CO2能促進部分菌株的生長。軍團菌生長緩慢,易于被其它菌落覆蓋。軍團菌的菌落顏色多樣,通常呈白色、灰色、藍色或紫色,也能顯深褐色、灰綠色、深紅色。菌落整齊,表面光滑,在紫外燈下,有熒光。目前軍團菌分為64種血清型及42個種。
     二、軍團菌的檢測方法---ISO11731:1998 
    1.范圍
     本標準描述了一種用于軍團菌分離和估計環境樣品中軍團菌數量的培養方法。該方法適用于所有環境樣本,包括飲用水、工業用水和天然水以及沉淀物、沉積物和粘土/軟泥等相關樣本。
    2.培養基和試劑
    2.1:CP0020 BCYE平板(軍團菌生長平板)                 
    2.2:P0030 BCYE-CYS平板(BCYE無L-半胱氨酸平板)      
    2.3:CP0040 GVPC選擇性平板(軍團菌選擇性平板)       
    2.4:酸處理緩沖液
    3.取樣
    3.1取樣容器
    水樣可采用玻璃、聚乙烯或類似容器。以前用過的容器應該清洗干凈、扣干水分,121℃高壓滅菌15min。如果容器不能經受高壓滅菌,應在高于70℃的流動熱水或流動蒸汽中處理至少5min。
    3.2含生物防腐劑的樣品
    如果水樣中含有或被認為含有氧化型生物防腐劑,應在取樣時或取樣前加入非活性試劑加以中和。如果水樣中含有消毒劑,需在采樣前或采樣后加入中和劑,含氯或氧化型消毒劑可用硫代硫酸鈉或硫代硫酸鉀作中和劑。原則上講,實驗室接到水樣后應盡快進行微生物學分析,最好是取樣當天,尤其對于已知含生物防腐劑的樣品。因此,建議從樣品采集到制備好濃縮樣的間隔最好為2d,不應超過5d,最長不超過14d。
     3.3樣品運輸
    樣品應在6-18℃條件下被運輸,應避免熱和光照,最好在1d內,不超過2d將樣品送到指定實驗室。
    4.制樣
    4.1 總則
    如果液體樣品軍團菌的數量估計超過105CFU/L,可以采用直接平板法,即直接涂布于GVPC平板。為了確保低于這個數量樣品中軍團菌的檢測,需采用濃縮技術。為了濃縮水樣,可采用膜過濾法(4.2)或離心法(4.3)。
    4.2膜過濾法
    如果樣品是渾濁的、乳濁的或有顏色的,應采用離心法。采用MFS型膜過濾裝置進行膜過濾,采用直徑47mm,孔徑0.22μm和0.45μm的無菌白底黑格膜。過濾后的膜應放置在帶蓋的無菌容器中,可用無菌剪刀剪碎,加5ml-25ml的無菌稀釋液或無菌去離子水,不斷搖動至少2min。也可將容器放入超聲波中2-10min。
    4.3.離心法
    取200ml樣品于300-500ml容積的離心瓶中,6000g離心10min或3000g離心30min,保持溫度在15-25℃,棄去上清液,將沉淀物懸浮在2-20ml無菌稀釋液或無菌去離子水中。
    培養
    5.1.將制備好的樣品(濃縮的或未濃縮的)分成3份,1份不做任何處理;1份進行熱處理;1份進行酸處理。
    5.2熱處理:加1±0.5ml樣品于一無菌容器中,50±1℃水浴處理30±2min。
    5.3.酸處理:加1-10ml樣品于一擰蓋的容器中,6000g離心10min或3000g離心30min,用無菌槍頭吸去一半體積的上清液,通過渦旋重新懸浮剩余物用酸處理緩沖液補足原始體積?;旌响o置5±0.5min。
    5.4.革蘭氏染色:團菌生長較慢,次日生長的菌落可直接棄去。軍團菌菌落顏色多樣,通常呈白色、灰色、藍色或紫色,也能顯深褐色、灰綠色、深紅色。菌落整齊,表面光滑,在紫外燈下有熒光。軍團菌為革蘭氏陰性桿菌。
    5.4.菌落驗證:從每個平皿上選幾個可疑菌落,接種BCYE、BCYE-Cys平板和血平板進行傳代培養,凡在BCYE平板上生長,而在BCYE-Cys平板上不生長的菌極可能是軍團菌。
    5.5.軍團菌計數:從三個GVPC平板中選擇確證菌數最多的平板進行計數,再除以濃縮倍數,作為軍團菌數的估計值。
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